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circβ-catenin翻譯蛋白產生的“正反饋”效應
來源: | 作者:geneseed | 發布時間: 2019-05-23 | 180 次瀏覽 | 分享到:

 

今天分享的是一篇最近發表在Genome Biology(IF=12.66)上的有關circβ-catenin翻譯蛋白正反饋激活Wnt信號通路的研究,通訊作者廣州中醫藥大學第一附屬醫院的Jin-Fang Zhang、南方醫科大學藥學院的Wei-Ming Fu和中山大學第三附屬醫院的Qi Zhang。

 

 

考慮到Wnt/β-catenin信號通路在肝癌發生過程中的重要性,作者選擇了該通路相關的143個基因,利用了circBase數據庫分析了這些基因可以產生的circRNAs。體外分析了7種非腫瘤細胞和6種腫瘤細胞,發現了大部分細胞都能產生數百種Wnt通路相關的circRNAs。作者在聚焦HepG2肝癌細胞,48Wnt通路相關基因可產生131circRNAs?;?/span>β-cateninWnt通路的主要調控者,是唯一一個在多個測序數據結果中均能檢測到的circRNA,而且在肝癌組織中其拷貝數目經常出現增加的特性,作者篩選出β-catenin來源的circRNA——circβ-catenin,其主要存在細胞胞漿中。通過qRT-PCR檢測,發現在不同人組織中circβ-cateninβ-catenin mRNA的表達水平呈現正相關的關系。

circβ-catenin的表達水平在肝癌組織和肝癌細胞系中明顯上調,為進一步了解circβ-catenin在肝癌發生中發揮的作用,利用shRNA敲低circβ-catenin表達,在不影響正常β-catenin mRNA表達水平基礎上,體外MTT實驗、克隆形成實驗、流式周期分析、遷移和侵襲實驗證明,敲低circβ-catenin表達后細胞的增殖、遷移和侵襲能力明顯降低,細胞阻滯在G1/S期。如果同時過表達circβ-catenin,則會rescue這些表型;但是過表達攜帶突變啟動子的circβ-catenin載體,則無法rescue這些表型,說明能否rescue成功有可能取決于circβ-catenin編碼蛋白的功能。

 

利用circβ-catenin穩定敲低的Huh7細胞株,建立在裸鼠皮下成瘤、在肝組織原位成瘤和在尾靜脈注射后觀察肺轉移等模型,發現敲低circβ-catenin表達可以明顯抑制腫瘤細胞在體內的生長和轉移。

 

經生信分析和qRT-PCR驗證,敲低circβ-catenin表達影響到的基因主要參與Wnt/β-catenin信號通路。敲低circβ-catenin表達可影響circβ-catenin表達和β-catenin蛋白水平,而不影響β-catenin mRNA水平,提示circβ-catenin可能調控β-catenin轉錄后翻譯或者降解的過程。熒光素酶報告基因實驗證明,與敲低β-catenin mRNA表達的結果一致,敲低circβ-catenin表達可以抑制β-catenin的結合作用。同時敲低β-catenin或者circβ-catenin表達均可抑制β-catenin靶基因的表達,提示circβ-catenin調控β-catenin表達,進而影響β-catenin靶基因的表達。

 

經生信預測分析,circβ-catenin含有一個內部核糖體進入位點IRES,有可能編碼長度為370aa的新型β-catenin蛋白。β-catenin-370aa含有與正常β-catenin一樣的N端氨基酸序列,但它的C端 含有9個特異的新氨基酸。利用識別N端序列的β-catenin抗體IP下來后進行質譜分析,證實了這種β-catenin-370aa蛋白的存在。免疫熒光實驗證明β-catenin-370aa蛋白主要定位在胞漿。Dual-Luciferase報告系統證明,circβ-catenin中的推測IRES序列具有啟動基因翻譯的能力。

 

從前面的結果提示circβ-catenin可能調控β-catenin轉錄后翻譯或者降解過程,β-catenin的穩定性與其磷酸化狀態緊密相關。因為GSK3β磷酸化β-cateninSer33/Ser37/Thr41位點后,β-catenin被泛素連接酶泛素化后經蛋白酶體降解。敲低circβ-catenin表達可明顯降低β-cateninSer33/Ser37/Thr41位點的磷酸化水平。另一方面,由于GSK3β主要通過結合β-cateninN端發揮作用,而circβ-catenin翻譯的蛋白β-catenin-370aa也包含N端同源序列,co-IP實驗進一步證明GSK3β也與β-catenin-370aa存在相互結合,而敲低circβ-catenin表達則增強GSK3β與全長β-catenin蛋白的結合,促進β-catenin的泛素化,過表達β-catenin-370aa則抑制兩者的結合,提示circβ-catenin可能通過抑制β-catenin泛素化,增強其穩定性。總之,這些結果提示了circβ-catenin編碼的β-catenin-370aa可能通過競爭性抑制GSK3β對全長β-catenin的磷酸化后的泛素化降解。

 

 

小結:本文的研究鑒定了致癌基因β-catenin來源的環狀RNA——circβ-catenin,首次報道circβ-catenin編碼了新型的β-catenin-370aa蛋白,競爭性抑制GSK3β磷酸化后導致β-catenin的降解,導致Wnt/β-catenin通路的不斷活化,形成正反饋效應,促進肝癌細胞的生長增殖和轉移,也是本文的一大亮點。但是缺點在于體外探討的分子機制沒有在體內腫瘤模型中得到很好的驗證,也沒有對circβ-catenin是否會通過sponge或者調控基因轉錄方面的功能進行深入的探討和排除。

 

參考文獻

1. Liang WC, Wong CW, Liang PP, et al. Translation of the circular RNA circβ-catenin promotes liver cancer cell growth through activation of the Wnt pathway. Genome Biol. 2019 Apr 26;20(1):84. doi: 10.1186/s13059-019-1685-4.